植物在长期进化过程中，形成了复杂的抵御病原菌侵染的抗病机制。抗病机制具有多种表现形式，包括基础抗病性、病原菌诱导的抗性以及抗病基因(R gene)主导的抗性等。不同形式的抗病信号传导途径既有区别，也有重叠和交叉。其中的交叉点是植物整体抗病的重要调节因子。NPR1 (nonexpressor of pathogenesis related genes 1)就是抗病重要调节基因之一，它既是SAR (systemic acquired resistance)和ISR (induced systemic resistance)诱导抗性信号传导的交叉点，也是基础抗性以及部分抗病基因所决定抗性的重要调节基因。

NPR1基因最早从拟南芥中克隆(Cao et al., 1997)，该基因位于1号染色体，含有4个外显子和3个内含子，编码的蛋白包含593个氨基酸，分子量约66 kD。NPR1在植株体内组成性表达。通常情况下，NPR1单体在细胞质中通过分子间二硫键形成寡聚体而存在。在SAR反应中，水杨酸的累积增加了细胞内的还原势，从而破坏了NPR1寡聚体中的二硫键，寡聚体解离为单体，单体在C末端的核定位序列引导下，在细胞核内积累，与TGA等转录因子发生互作，激活下游防卫基因表达而产生抗性(张红志和蔡新忠, 2005)。

目前，烟草(Liu et al., 2002)、水稻(Chern et al., 2005)、棉花(王旭静等, 2006)、中间偃麦草(唐益苗等, 2007) 、苹果(Malnoy et al., 2007)、梨(Che et al., 2008)、香蕉(Endah et al., 2008)、大豆(Sandhu et al., 2009)、甘薯(陈观水等, 2009)、葡萄(Henanff et al., 2009)、可可树(Shi et al., 2010)等植物中的NPR1基因已经被克隆，表明NPR1介导的抗性途径可能是多种植物共同保守的途径。研究发现，作物中过量表达NPR1基因可以提高其对病害的抗性。例如过量表达NPR1的拟南芥对细菌Pseudomonas syringae、真菌Peronospora parasitica和Erysiphe cichoracearum的抗性增加(Cao et al., 1998; Friedrich et al., 2001)；转基因番茄中过量表达拟南芥AtNPR1表现出对病原菌的广谱抗性(Lin et al., 2004)；转基因苹果过量表达苹果MpNPR1对病原菌Erwinia amylovora、Venturia inaequalis和Gymno-sporangium juniperi-virginianae的抗性增加；单子叶植物中过量表达AtNPR1，同样也会提高植物抵御病原菌的能力，在水稻中过量表达AtNPR1和水稻OsNPR1基因都增加了对白叶枯病菌Xanthomonas oryzae的抗性(Chern et al., 2001; 2005; Yuan et al., 2007)；在小麦中过量表达AtNPR1增加了对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum的抵御能力(Makandar et al., 2006)；表明单子叶植物与双子叶植物可能拥有相同的NPR1抗病调控途径。

小麦纹枯病(Wheat sharp eyespot)是中国长江流域中下游麦区和黄淮麦区的主要病害，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander hoeven)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)是其主要病原菌，每年造成严重的产量损失，选育和使用抗纹枯病小麦新品种是防治该病害最经济和有效的途径。迄今为止，尚未发现对该病害免疫的小麦品种(系)，高抗的材料也较匮乏。研究发现，小麦纹枯病抗性是数量性状，主基因效应不大，并且存在基因互作，给常规育种带来诸多困难(蔡士宾等, 2006)。转基因技术由于周期短、针对性强等优点，已经成为小麦抗纹枯病育种的新手段(Chen et al., 2008)。

本研究构建了拟南芥AtNPR1基因的单子叶作物组成型高表达载体，并通过基因枪介导将其导入小麦扬麦12号，进一步分析了AtNPR1基因在转基因小麦后代中的表达以及对小麦纹枯病的抗性，以评估转基因小麦中AtNPR1基因能否正常表达以及该基因在基因工程培育抗纹枯病小麦中的应用潜力。

1结果与分析
1.1 AtNPR1基因的克隆和载体构建
根据AtNPR1基因DNA序列设计引物，采用PCR方法从拟南芥基因组扩增出2 125 bp的DNA片段，连接到pGEM-T载体，经测序和Blast验证，扩增片段确实含有AtNPR1基因，该基因全长2 079 bp，包含4个外显子和3个内含子，内含子的大小分别为79 bp (位于562-640)、108 bp (位于1 377-1 484)和110 bp (位于1 689-1 798)。采用SmaⅠ和SacⅠ双酶切获得AtNPR1基因，替代pACH25载体(Christensen and Quail, 1996)中的gus基因，即获得Ubiquitin启动子驱动的AtNPR1基因表达载体pAC-NPR1 (图1)。

图1 质粒pAC-NPR1 构造 Figure 1 Construct of plasmid pAC-NPR1

1.2小麦的遗传转化与分子检测
共转化6 300枚小麦幼胚，通过愈伤诱导、分化以及L-PPT筛选，获得抗L-PPT再生植株126株，对其T₁后代喷施Basta除草剂，发现27株的后代出现抗感分离，初步定为阳性植株。对这27株进行PCR检测发现，20株含有AtNPR1基因(图2)，其余7株未能扩增出相应片段，可能转基因植株只插入了bar基因片段或AtNPR1基因的片段。

图2 部分T0 代转基因植株AtNPR1 基因的PCR 检测 注: M: DL2000 marker; 1: pAC-NPR1; 2: 扬麦12 号; 3~17: 转基因植株 Figure 2 PCR analysis of AtNPR1 gene in part of T0 transgenic plant Note: M: DL2000 marker; 1: pAC-NPR1; 2: Yangmai12; 3~17: Transgenic plants

1.3转基因阳性植株的表达分析
采用Basta除草剂喷涂和PCR检测相结合的方法筛选AtNPR1基因纯合的转基因株系，并对这些转基因株系的农艺性状同时进行鉴定筛选。从转基因后代株系中选取与受体亲本扬麦12号农艺性相近的14个转基因株系分析AtNPR1基因的表达以及对小麦纹枯病的抗性。

采用18S rRNA作为内参基因，对转基因对照扬麦12和14个转基因株系AtNPR1基因的半定量RT-PCR分析结果发现，R3、R4、R7、R8、R9、R10和R13等7个株系扩增出635 bp的亮带；R2、R14和R15等3个株系扩增出853 bp和1165 bp两条带；R6和R11等2个株系只有微量表达，R5和R12等2个株系没有扩增条带(图3)。将扩增的各个DNA条带回收、测序和Blast分析结果显示，635 bpDNA条带为内含子正常剪切和表达的AtNPR1基因片段；853 bp条带为108 bp和110 bp的2个内含子未剪切的表达片段；1 165 bp条带为如图4所示插入基因发生复杂片段重排的表达片段。

图3 转基因株系AtNPR1 基因的半定量RT-PCR 分析 注: M: 100 bp DNA ladder marker; R1: 扬麦12 号; R2-R15 转基因株系; R2, R14 和R15: 来自S1-1; R3 和R4 来自S44-1; R6 和R11 来自S89-1; 其余来之不同转基因植株 Figure 3 Semi-quantitative RT-PCR analysis of AtNPR1 gene in transgenic lines Note: M: 100 bp DNA ladder marker; R1: Yangmai12; R2-R15: Transgenic lines; R2, R14 and R15 from S1-1; R3 and R4 from S44-1; R6 and R11 fromS89-1; The other transgenic lines derived from different transgenic plant

图4 转基因植株S1-1 中的AtNPR1 基因片段重排 注: 箭头表示片段方向; 方框表示未知序列; 上排数字表示重排基因片段的位置; 下排数字为原基因中片段位置 Figure 4 The rearrangement of AtNPR1 fragments in transgenic plant S1-1 Note: The arrows indicate the direction of fragments; The boxes indicate unknown DNA sequences; The number of up line indicates the location of fragments in the rearranged gene; The number of lower line indicates the location of fragments in the original gene

正常表达(切除内含子)的7个株系中，R9的表达最强，其次为R3、R4和R13，R7、R8和R10的表达相对较弱。

1.4转基因株系的纹枯病抗性鉴定
纹枯病抗性鉴定结果表明，R5和R12等2个AtNPR1基因未表达的转基因株系以及R6和R11微量表达的转基因株系的纹枯病抗性与未转基因受体对照扬麦12号差异不显著；R2、R14和R15等3个AtNPR1基因内含子未切除的转基因株系的纹枯病抗性较对照也未有显著提高；正常表达的R3、R4、R7、R8、R9、R10和R13等7个株系的纹枯病抗性较扬麦12号提高明显，平均病级和平均病情指数均显著低于未转基因受体对照，纹枯病病级和病情指数比对照平均分别降低24.2%和25.0%，以R8的降低幅度最大，抗性提高最明显(图5)，但AtNPR1基因正常表达转基因株系的病级和病情指数的降低程度与该基因的表达强度没有明显的相关性(表1)。

图5 转基因小麦R8 株系的纹枯病抗性 注: A: 扬麦12 号品种; B: R8 转基因株系 Figure 5 Resistance of transgenic line R8 to Sharp eyespot Note: A:Yangmai12; B: R8 transgenic line

表1 转AtNPR1基因株系的纹枯病抗性 Table 1 The resistance of AtNPR1 transgenic lines to wheat sharp eyespot

2讨论
AtNPR1基因是重要的抗病调节基因，不仅在拟南芥，在其他植物中过量表达都可以提高植物对多种病害包括真菌病害侵袭的抵抗能力。本研究将玉米高表达ubiquitin启动子驱动的AtNPR1基因导入普通小麦，并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦株系，进一步验证了AtNPR1基因在植物抗病反应中的重要作用。研究也发现，在AtNPR1基因正常表达的株系中，其纹枯病抗性与植株中AtNPR1基因表达强度相关不明显，这与以转Rs-AFP2等抗病下游基因以及抗真菌蛋白基因为目的基因的转基因作用方式不同，Rs-AFP2等这类基因的表达产物直接作用于病原真菌，因而浓度越高，作用越强(路妍等, 2009)，而AtNPR1基因为调节基因，下游抗病基因的表达只需一定量的AtNPR1基因表达即可激活，AtNPR1基因过量超表达，对提高下游防卫基因的表达帮助不大，Friedrich等(2001)在拟南芥中过表达AtNPR1基因也发现类似的研究结果。

目的基因沉默现象是转基因研究中常见的现象，主要为同源依赖性沉默(Homology-dependent gene silencing)和位置依赖性基因沉默(Postion-dependent gene silencing)，前者由同源或互补核甘酸序列间相互作用产生，多为转基因出现多拷贝或与内源基因相互作用而诱发的基因沉默；后者则反映转基因宿主的后成状态或染色体特异区段对外源DNA入侵忍耐性的强弱(Stam et al., 1997)。本研究也发现2个转基因株系虽然可以检测到AtNPR1基因的存在，但未检测到该基因的表达，由于尚未有Southern杂交的结果，目前还很难判定基因沉默是由多拷贝插入引起还是由于插入了小麦异染色质等部位引起。

真核生物的基因大多含有内含子，基因表达时首先形成前体RNA，再经内含子的剪切形成成熟的mRNA，以进行下一步的翻译和调控。内含子剪切识别位点的强弱、内含子的长度、相邻外显子的序列以及前体RNA的二级结构等都会影响内含子的正确剪切，特别是识别位点的突变极易造成内含子的剪切错误(陈县明, 2010)。本研究由转基因植株S1-1形成的纯合后代株系中AtNPR1基因所含内含子均不能切除，测序结果发现，RT-PCR扩增的853 bp片段中，两个内含子的识别位点都没有发生突变，表明内含子未剪切不是由识别位点突变引起，RT-PCR除扩增出853 bp片段，还有表达量稍低1 165 bp片段出现，测序结果显示该片段是基因重排的结果，在重排的基因中，位于AtNPR1基因的562~640 bp和1 377~1 484 bp间的内含子均未出现在表达序列中，原位于1 689~1 798 bp的内含子只有1 777~1 789 bp出现在重排基因中，失去了内含子识别的5'ss (splice site)序列，推测可能是该重排基因的表达干扰了AtNPR1基因的正常剪切，未能形成有功能的表达产物，转基因株系的表型—纹枯病抗性未有显著提高。

3材料与方法
3.1植物材料
拟南芥为哥伦比亚生态型，为本实验室保存。江苏里下河地区农科所小麦室提供扬麦12号转基因受体品种，开花后12~14 d的小麦幼胚用于转化研究。

3.2 AtNPR1基因的克隆及载体构建
采用CTAB法提取拟南芥叶片DNA。根据AtNPR1基因DNA序列(GenBank accession no. EF470-723)设计PCR扩增引物对AtNPR1-F：5'-acccgggCTGTTGATGGACACCACCATTGATGG-3' (下画线为引入的SmaⅠ酶切位点)和AtNPR1-R：5'-agagctcGCAAAAATTACACTAAGAGGCAAG-3' (下画线为引入的SacⅠ酶切位点)，以提取的叶片DNA为模板，采用TaKaRa LA Taq酶扩增AtNPR1基因，回收2 125 bp的扩增片段，连接到pGEM-T载体(Promega)，产生pGEM-T-NPR1质粒，生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果进行Blast验证。

采用限制性内切酶SmaⅠ和SacⅠ双酶切质粒pGEM-T-NPR1，获得AtNPR1基因，将该基因替换质粒pACH25 (Christensen and Quail, 1996)中的SmaⅠ和SacⅠ位点间的gus基因即获得表达载体pAC-NPR1，其中玉米Ubiquitin组成型高表达启动子控制AtNPR1基因的表达，bar基因为筛选标记基因，该基因抗除草剂L-PPT (L-phosphinothricin) (图1)。

3.3小麦转基因植株的获得
小麦转化过程中，质粒提取和包裹金粉以及基因枪轰击的参数按周淼平等(2008)文献略作修改。基因枪轰击前后用0.4 mol/L山梨醇高渗处理幼胚16 h，轰击后，在未加选择压的愈伤诱导培养基(MS基本培养基添加2 mg/L 2,4-D)暗培4 d后，转入添加3 mg/L L-PPT愈伤诱导培养基诱导培养21 d，抗性愈伤然后转入分化培养基(MS基本培养基添加1 mg/L KT和1 mg/L NAA以及3 mg/L L-PPT)分化42 d，再生抗L-PPT幼苗转入生根培养基(1/2MS添加3 mg/L L-PPT)，待幼苗长至6~8 cm长时转移至盆钵，取叶片样品提取DNA用于分子检测，套袋自交结实收获T₀代种子。

T₀代种子播于72孔塑料穴盆中，萌发产生T₁代植株，于2~3叶时喷施含100 mg/L L-PPT有效成分的Basta除草剂溶液继续筛选，根据T₁代植株抗Basta的分离结果推断T₀代植株是否为转基因阳性植株。

3.4转基因小麦AtNPR1基因的分子检测
采用CTAB法抽提抗Basta植株的叶片DNA，进行AtNPR1基因PCR检测，上游引物(NPR1-F1)：5'-GAAGGTAGAACCGCACTC-3'；下游引物(NPR1- R1)：5'-GTCGAATCTGTCAGGGAC-3'，预期扩增片段为853 bp，含108 bp和110 bp的2个内含子。PCR的总体积为20 μL，含1×Buffer、1.5 mmol/L MgCl₂、0.2 mmol/L dNTPs、 0.5 μmol/L引物、50 ng模板DNA、1 U Taq酶(TaKaRa)。PCR条件为95℃先预变性3 min；然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，扩增35个循环；然后72℃延伸7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增片段。

3.5转基因小麦AtNPR1基因的表达分析
用SV Total RNA Isolation System试剂盒(Promega)提取T₅代转基因植株叶片总RNA，按照Prime-Script RT-PCR 试剂盒(TaKaRa)说明书合成cDNA并进行半定量RT-PCR分析，AtNPR1基因扩增引物与分子检测相同，正常表达(切除内含子)的预期扩增片段为635 bp。采用18S rRNA基因作为内参基因(18S-QF: 5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'; 18S QR:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3')。PCR的总体积为25 μL，含1×Buffer Ⅱ、0.4 mmol/L dNTPs、0.6 μmol/L引物、2 μL cDNA模板、1.25 U Ex Taq HS酶(TaKaRa)。PCR程序为95℃先预变性3 min；然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，扩增30个循环；然后72℃延伸7min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增片段。部分扩增产物的测序和验证同3.2。

3.6转基因小麦的纹枯病抗性鉴定
采用病麦粒接种法鉴定转基因小麦的纹枯病抗性。拔节期时将带有禾谷丝核菌R. cerealis R0301菌丝的病麦粒均匀播于转基因小麦植株基部，弥雾保湿7 d。小麦乳熟期时调查纹枯病发病情况，每个转基因株系随机调查15个发病茎秆，重复2次，病级调查按1~5级标准，1级：叶鞘有典型病斑，病菌不侵入茎杆；2级：病菌侵入茎秆，但病斑宽度不超过茎秆周长的1/2；3级：病斑宽度在1/2~3/4茎秆周长之间；4级 ：病斑宽度占茎秆周长的3/4以上；5级：枯孕穗或枯白穗。分别计算各转基因株系平均病级和平均病情指数。平均病情指数={(¹×χ¹+2×χ²+3×χ³+4×χ⁴+5×χ⁵)/[(χ¹+χ²+χ³+χ⁴+χ⁵)×5]}×100，式中：χ¹,χ²,…，χ⁵分别代表1,2, ……5级的茎秆数。采用SAS 9.0软件进行方差分析。

作者贡献
周淼平、杨学明、张鹏和余桂红是本研究的实验设计和实验研究的执行人；周淼平是项目的构思者及负责人，完成数据分析和论文初稿的写作；姚金保和马鸿翔指导实验设计和论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08002001)、江苏省产学研联合创新基金(BY2012208)、江苏省科技支撑计划项目(BE2011306)、国家科技支撑项目(2011BAD35B03)和江苏省农业科技自主创新资金(CX11-1025)共同资助。感谢江苏省里下河农科所小麦室提供扬麦12号小麦种子、江苏省农科院植保所陈怀谷研究员提供禾谷丝核菌R0301。

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